| 不同发育阶段圭山山羊胚胎常规冷冻保存研究 |
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| 编辑： 吴诗 2011-11-21 | |
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摘要：采用常规冷冻法冷冻保存圭山山羊桑椹胚、囊胚、扩张囊胚期胚胎。解冻后体外发育率分别为41．94％、67．50％、84．09％，桑椹胚与囊胚、扩张囊胚间差异显著(只，o．05)，囊胚和扩张囊胚间虽无显著性差异(P>0．05)，但扩张囊胚体外发育率高于囊胚。在胚胎的冷冻一解冻过程中，桑椹胚、囊胚、扩张囊胚的透明带受损伤率分别为6．45％、20．00％、31．82％，透明带受损的桑椹胚、囊胚、扩张囊胚体外发育率分别为0％、50．00％、78．57％，初步说明发育程度越高的胚胎，在冷冻一解冻过程中其透明带越易受到损伤，但随发育程度的加深，胚胎生长发育时对透明带的依赖程度也变得越来越弱，表明圭山山羊早期扩张囊胚最适宜进行冷冻保存。 畜禽种质资源是生物多样性的重要组成部分，地方品种的优异种质特性在当前及今后畜牧业可持续发展中将发挥重要作用。圭山山羊属乳肉兼用型品种，是云南省的地方优良品种之一，因其具有适应性强、母羊泌乳期长、繁殖率高、乳脂率高、产肉率高、体形外貌特别等特点，成为云南省唯一人选国家级畜禽遗传资源保护的羊类品种。由于受外来品种杂交改良的影响，纯种圭山山羊的数量正在减少，迫切需要开展种质资源保存相关研究。 山羊种质资源的保存方法主要有活体保种、生殖细胞保种和胚胎保种3种方式，活体保种成本较高，容易受环境等因素影响；生殖细胞保种包括精子和卵母细胞的冷冻保存，只能保存单一的配子；胚胎冷冻保存是成本较低、效果较好的一种种质资源保存方法，主要有玻璃化冷冻和常规冷冻法。常规冷冻法是利用程序降温仪，按照预先设计的降温程序将胚胎所处的环境降至一定温度，然后将其投入液氮中保存。该法采用较低浓度的抗冻保护剂，对胚胎造成的毒性损害较小，并且方法可靠，作为一种常用的哺乳动物胚胎冷冻保存方法，在冷冻保护剂的选择、平衡时间、植冰温度、降温速率、胚胎解冻等技术环节上已形成了一套完整的技术流程，在牛羊胚胎冷冻保存中被广泛应用，但未见该法在圭山山羊胚胎冷冻保存方面的报道。本试验拟采用程序化法冷冻保存不同发育阶段的圭山山羊胚胎，比较不同发育阶段胚胎冷冻—解冻后的体外发育效果，为地方山羊种质资源保存提供支撑。 1材料与方法 1．1主要试剂材料孕激素(P)：EAZI—BREED，CIDR，新西兰产，每个CIDR含孕激素0． 1．2冷冻用胚胎的获取选择健康、繁殖机能正常的2～5岁圭山山羊作为胚胎供体，采用“孕激素+FSH”法对供体羊进行超数排卵处理，供体羊发情后采用圭山山羊公羊配种，于发情后第60天采用手术法从子宫角回收桑椹胚至囊胚期胚胎。 1．3冷冻预处理液、冷冻液和解冻液的配制 1)预处理液：用1．5 mol／L的EG原液和Holding液分别配制成0．5 mol／L EG和1．0 mol／L EG。 2)冷冻液：1．5 mol／L EG。 3)解冻液：用1．0 mol／L的蔗糖原液和Holding液配制成0．5 mol／L和0．3 mol／L的蔗糖溶液。 1．4胚胎的程序化冷冻保存 1)实验准备：实验前2 h将室温调至 2)冷冻保存：在室温下先将准备好的胚胎分步移入含0.5 mol／L EG、1.0 mol／L EG的预处理液中，各平衡5.0min，再将胚胎移人预先装有1．5 mol／L EG的0．25 mL塑料细管内平衡15 min，然后将装有胚胎的细管放入程序冷冻仪内，以-3.0 oC／rain的速率降温至-6.5℃，人工植冰，保持10 rain后，再以-0.3 oC／min的速率降温至一35.0℃，保持10 min后取出细管投入液氮中保存。 1．5冷冻胚胎的解冻冷冻的胚胎于液氮中保存380 d后解冻，实验前2 h将室温调至 胚胎解冻：在25℃室温下，将细管从液氮中取出，在室温和30℃水浴中分别晃动10 s，取出细管擦干，剪掉栓部，用内含0.5 mol／L蔗糖液的注射器将细管内容物冲洗到表面皿中，在体视显微镜下回收胚胎，然后将胚胎移入新鲜的0.5 moFL、0.3 mol／L蔗糖液中分别平衡6.0 min，用Holding液洗净胚胎后，移人体外培养液中培养。 1．6解冻胚胎的培养、发育能力评价 将解冻后的胚胎置于预平衡2 h以上、上覆石蜡油的100斗U滴的胚胎体外培养液(mSOFaa液)中，在38. 1．7数据分析采用卡方检验进行分析。 2 结果 2．1不同发育阶段圭山山羊胚胎冷冻—解冻效果实验分别冷冻了桑椹胚、囊胚、扩张囊胚期胚胎，解冻后体外发育率分别为41．94％、67．50％、84．09％．经卡方检验，桑椹胚与囊胚、扩张囊胚间差异显著(P>0.05)，囊胚和扩张囊胚间差异不显著(P>0．05)，但扩张囊胚冷冻一解冻后的体外发育率高于囊胚(详见表1)。
2．2不同发育阶段胚胎冷冻一解冻后透明带损伤比较在胚胎的冷冻—解冻过程中，部分胚胎的透明带易受损伤，桑椹胚、囊胚、扩张囊胚的透明带受损伤率分别为6.45％、20.00％、31.82％，随胚胎发育阶段的推进，透明带损伤率增高；对透明带受损伤的胚胎进行体外培养，桑椹胚、囊胚、扩张囊胚的发育率分别为0％、50．00％、78．57％，初步说明发育程度越高的胚胎，在冷冻—解冻过程中其透明带越易受到损伤；发育程度越高的胚胎，其生长发育对透明带的依赖程度也越来越弱。 3分析与讨论 尽管哺乳动物胚胎冷冻保存技术已经出现30多年，冷冻技术的研究也取得了很大进步，但到目前为止，常规慢速冷冻法仍然是哺乳动物胚胎冷冻保存的主要方法。此方法选择较低浓度的渗透性冷冻保护剂，采用缓慢降温和快速解冻的方法来冷冻保存胚胎。本实验中桑椹胚与囊胚、扩张囊胚间冷冻—解冻后发育率差异显著(P>0.05)，与黄凤玲等的实验结果相一致，可能是由于桑椹胚以卵裂球形式存在，含水量较高而细胞数少，在冷冻平衡过程中，一些卵裂球脱水不够充分或冷冻液渗透不均匀，解冻后容易使部分卵裂球破碎，从而导致整个胚胎后续发育能力下降，而囊胚和扩张囊胚在冷冻—解冻过程中内细胞团是整体收缩和扩张恢复过程，不易受冰晶形成的破坏。扩张囊胚与囊胚相比胚胎内细胞团发育更为成熟，使得抗冻性更强。因此，圭山山羊胚胎冷冻保存适宜选用扩张囊胚期胚胎。 透明带是胚胎的重要组成部分，在冷冻—解冻过程中对胚胎有保护作用，可防止胚胎冷冻时形成的冰晶对胚胎细胞原生质的物理损伤。冷冻—解冻过程会造成透明带本身破损、断裂或脱落，还可对其内在性质产生影响，但相关的报道较少。Moreira da Silva等(2005)用扫描电镜观察牛体外培养的桑椹胚和囊胚冷冻后透明带的变化，结果表明冷冻后透明带外表面的孔径发生变化，说明冷冻对透明带有一定影响。实验中桑椹胚、囊胚和扩张囊胚冷冻—解冻后透明带损伤率分别为6.45％、20.00％和31.82％，受损均为透明带破损，桑椹胚和囊胚、扩张囊胚透明带损伤率差异显著(P<0.05)，这可能是因为随着胚胎的发育，胚胎的透明带变得越来越薄，导致冷冻—解冻过程透明带破损。透明带受损的桑椹胚、囊胚和扩张囊胚的体外发育率依次增高(0％，50.00％、78.57％)(P<0.05)，说明透明带是否完整对胚胎的体外发育影响较大，早期胚胎的体外发育对透明带完整性的依赖程度更强，而随着胚胎发育程度的推进，胚胎生长发育对透明带的依赖程度也变得越来越弱。 本实验扩张囊胚的冷冻—解冻效果均好于囊胚和桑椹胚，在实际操作中，应尽量选择发育良好的早期扩张囊胚进行冷冻保存，当胚胎发育到扩张囊胚后期时，冷冻时机把握不好，胚胎就会发育到孵化期，这时细胞团脱出透明带会给冷冻带来不便。
摘自《中国草食动物2010年第30卷第6期》
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